免疫荧光染色

实验原理

 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

实验步骤

1. 洗载玻片：将载玻片置于重铬酸钾和浓H₂SO₄混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H₂SO₄(大约冲一个小时左右)，再将载玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

2.包埋组织：先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

3.切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为 5μm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。

4.捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。

5.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯, 依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放10min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话，就要适当延长脱蜡时间，一般为12-15min。

6.抗原修复：我们采用电陶炉进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的耐高温塑料切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度，电陶炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。到时间后将烧杯从电陶炉中取下，自然冷却，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。

7.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900μlPBS：100μl血清封闭液）。

8.加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。

9. 加荧光二抗： PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。（注意：此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行。）

10. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。

11. 用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

结果判读

目的蛋白为红色或者绿色（荧光素不同颜色不同），细胞核为蓝色；

注意事项

1，目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果；

2，蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果；

3，DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色；

4，组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色；

5，采集图像过程不当，导致原始图像不佳，直接影响后续半定量分析。

常见问题解析

1、非特异性染色

原因：1）检查所用荧光团的光谱是否重叠：调整滤镜和光源，更改为激发光谱或发射光谱没有重叠的荧光团。

2）一抗种属来源与被分析的样本物种相同：更换抗体；使用与二抗来源物种相同的血清作为封闭液；用针对一抗种属的单价Fab片段封闭一抗，然后用二抗对单价Fab片段进行可视化，可避免与样本本身的Fc受体结合而引起非特异染色。

3）切片中存在杂质引起非特异荧光：二抗使用前离心，将不溶杂质或游离的染料沉淀到底部，吸取上清进行实验；甲醛固定后样本，可用甘氨酸淬灭残留的醛。

2，弱染色

可能是由多种原因引起的：检查曝光时间和强度；改变固定或孵育时间；确保抗体/同型的兼容性；测试抗体稀释范围和样品浓度；保证正确的试剂和载玻片的制备和储存方法；检查设备不兼容性。

3、背景信号

原因：1）试剂或样本问题：降低抗体浓度（一级或二级）；使用较薄的组织切片；通过对照检查二抗特异性，如果发生非特异性结合，则更换二抗。

2）封闭可能不足：增加封闭孵育时间或使用其他封闭剂；用与二抗种属相同物种的正常血清封闭。

3）可能是由于自发荧光引起的：检查未染色的部分；游离醛可以用硼氢化钠洗涤除去，并避免使用戊二醛固定剂；预光漂白内源性分子，导致使用苏丹黑染色；减少显色的孵育时间；考虑远离488 nm通道，并使用与自发荧光不同的发射波长的荧光团。

4、目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果

原因：首先要检查一下抗体对不对，是否适用于你的预处理组织。一个典型的例子就是，有些抗体只适用于冰冻切片，但若将其应用于石蜡切片，就会造成弱标记或无标记现象。此外，如果抗体修复不充分，抗原表位未完全暴露，也会出现弱标记现象。比如，尽管大多数抗体都是在酸性环境中修复，但是也存在少量的抗体需要在碱性环境中修复，建议查看抗体说明书，严格按照其修复条件进行实验。

5、目标蛋白的荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果

原因：一般出现在抗体浓度过高而漂洗又不充分的时候。多余的抗体会吸附在组织上，造成荧光图像整体高背景。适当降低一抗或者二抗的浓度，增加漂洗时间，一般能够有所改善。

6、DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色

现在都是使用的防荧光衰减DAPI试剂，使用时滴上一滴就能将细胞核标记。

原因：滴加的DAPI不要太多，只需覆盖上薄薄的一层即可。事实上，个人认为只要切片没有暴露在自然光或者激发光之下，荧光的自然衰减并没有想象中那么快。

7、组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色

如果组织切片，尤其是石蜡切片脱蜡环节不彻底，也会造成区域性的非特异性标记。建议脱蜡一定要彻底，脱蜡前充分烤片也可以帮助脱蜡。

原因：玻片干燥了，同样会造成高背景或大面积的非特异性标记。漂洗环节和抗体孵育环节最容易出现干片现象，尤其是大批量实验时，一定要注意。使用免疫组化专用笔画个圈，可以有效改善。

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