tunel(荧光)染色

实验原理

 TUNEL染色是检测细胞凋亡染色的常见方法，其原理是细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180~200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素、生物素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或化学显色方法检测细胞凋亡的情况。

实验步骤

1.组织脱水：梯度酒精对组织进行脱水处理，75%酒精(4h)-85%酒精(2h)-90%酒精(1.5h)-95%酒精(1h)-无水乙醇I(0.5h)-无水乙醇Ⅱ(0.5h)；

2.组织透明：组织块经酒精脱水后必须经过透明。透明剂（二甲苯）能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织，无水乙醇：二甲苯(1:1)(10min)-二甲苯Ⅰ(10min)-二甲苯Ⅱ(10min);

3.浸蜡：透明后的组织块依次经3缸石蜡（60℃）进行浸蜡，石蜡Ⅰ(60℃)(1h)-石蜡Ⅱ(60℃)(1h)-石蜡Ⅲ(60℃)(1h);

以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成（机器自动程序）

4.包埋：包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。

5.切片和烤片：包埋好的蜡块使用徕卡病理切片机进行切片，切好的组织片放入40℃的水浴锅中进行摊片，防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃ 烤箱烤片3个小时即可。

6.切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ(20min)-二甲苯Ⅱ(20min)-二甲苯Ⅲ(20min)-无水乙醇Ⅰ(5min)-无水乙醇Ⅱ(5min)-95%酒精(5min)-90%酒精(5min)-80%酒精(5min)-70%酒精(5min)，然后蒸馏水浸洗5min。

7.用去离子水轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。用油性笔在组织周围描绘组织分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让组织干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
8.按1:100的比例，用去离子水作为稀释液来稀释2mg/ml的Proteinase K溶液,使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加100μl浓度为20μg/ml的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20min。

9.用去离子水溶液润洗样本，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

10. 按1:5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer。每个样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育15分钟。在平衡细胞的同时在冰上解冻BrightRed Labeling Mix，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。

表1.准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

11.在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉100μl 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在组织上加入TdT孵育缓冲液，不要让组织干片。把塑料盖玻片盖在组织上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于湿盒内，在37℃孵育60min。然后用PBS洗涤3次，每次5min 。

12.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。

13.用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

结果判读

凋亡细胞呈红色或者绿色(因荧光素不同而不同)，细胞核呈蓝色。

                 tunel(荧光)-小鼠脑-50X                                            tunel(荧光)-小鼠脑-200X

注意事项

1、 出现非特异性荧光标记：组织或细胞未充分固定;使用了不适当的固定液; TUNEL反应时间过长，或反应液渗漏。

2、荧光背景高：支原体污染片;细胞核中的DNA断裂；TUNEL反应过强，红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。

3、标记效率低：使用甲醇或乙醇固定，固定时间过长；未避光操作。

常见问题解析 

1.为什么设置阳性组、阴性组

阳性组：用来验证本次实验操作和试剂盒有无问题。

阴性组：a.排除细胞自身凋亡以及操作过程等原因导致的非特异性染色；b.调整拍摄曝光强度。

除此以外，大家或多或少会遇到染色结果异常，包括荧光信号弱、没有荧光信号、假阳性高、荧光背景强等问题。染色失败的原因主要包括样本处理不当、染色不充分、曝光时间过长等，可从以下几个方面对症分析。

2. 荧光信号弱或没有荧光信号

若已知细胞或者组织样本处于细胞凋亡状态，但是用TUNEL检测发现荧光信号偏弱或没有信号。

2.1样本处理不当
1）样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点，便于染色。
2）脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ℃ 20 min，再使用二甲-苯两次5-10 min；而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。
3）Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间，常用时间10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。
4）Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL。
5）放置在-20 ℃保存较长时间的切片不新鲜，减低染色效率。建议使用新鲜切片。
2.2染色操作不当
1）染色时间过短。建议一般 37℃ 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。
2）TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。
3）TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导致TdT酶失活。
4）样本干燥。加上TUNEL反应液后，请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行，保证样本均匀染色，又可防止反应液干燥。
2.3荧光检测操作不当
操作未避光。由于荧光易碎灭，建议标记与检测样本时，载玻片要避光，观察时要尽量快。

3.非特异性染色（假阳性高）

若已知细胞或者组织样本依然处于活细胞状态，但是用TUNEL试剂盒检测，出现了非特异性染色，和处理过的荧光信号一样强，甚至比阳性对照组荧光信号还要强。

3.1样本处理不当

1）使用酸性或碱性固定液，导致DNA损伤。建议使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。

2）固定液浓度过高，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议使用4%多聚甲-醛溶液（溶于PBS）。

3）固定时间过长，导致细胞自溶、DNA链不规则断裂、造成假阳性。建议控制固定时间在4 ℃放置25 min。

4）蛋白酶K处理时间过长，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当缩短处理时间。
5）蛋白酶K浓度过大，破坏核酸结构，出现假阳性。建议适当调整蛋白酶 K溶液浓度，一般工作液浓度为20 μg/mL。
3.2 染色操作不当
1）TUNEL染色时间过长。建议一般是 37℃ 孵育60 min，可以根据凋亡损伤程度，可长至2 h，但要结合背景着色。
2）未充分清洗样本。染色后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片的非特异性染色。
4.荧光背景强

4.1染色操作不当
1）TUNEL染色时间过长。建议染色时间适当，一般是 37 ℃ 孵育60 min，避免串色。
2）TUNEL染色液浓度过大。建议增大稀释倍数，优化浓度。
3) 使用试剂盒提供的二价阳离子优化反应，试剂盒中的Mg²⁺可降低背景，Mn²⁺可增强染色效果。
4）PBS未充分清洗样本。在TUNEL反应后PBS清洗次数可增加到5次，来避免切片样本中残留的染料。
4.2荧光检测操作不当
曝光时间过长。建议调整曝光条件，先对阴性组调整到无背景光，然后用这个曝光条件去拍摄实验组（可以微调，但是不需要大调）。

                                                              送检要求