多光谱免疫荧光组织成像技术

实验原理

在原有的免疫组化的基础上，多光谱免疫荧光技术通过TSA酪氨酸放大和微波洗脱的方法将抗原直接标记上携带不同激发波长的荧光素，从而达到多个指标同时标记的效果。

实验步骤
1.切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（20min）-二甲苯Ⅱ（20min）-二甲苯Ⅲ（20min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（5min）-90%酒精（5min）-80%酒精（5min）-70%酒精（5min），然后蒸馏水浸洗5min。

2.抗原修复：采用电陶炉加热对切片进行抗原修复，将配置好的修复液（Tris-EDTA缓冲液，pH9.0）放置于烧杯中高火煮沸，再将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯中的耐高温塑料切片架上，液面要浸过切片组织一定高度，此时开始计时，修复时间为15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。到时间后将烧杯从电陶炉面板移出，室温放置40min左右冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（pH7.4）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。

3. 阻断内源性过氧化物酶：将配制好的3%的过氧化氢滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15min，PBS冲洗3次，每次3min。

4.血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。

5.加一抗：用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的组织上滴加PBS。加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜（15h）。

6. 加酶标二抗：PBS 冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加HRP标记的山羊抗兔/小鼠二抗，37℃孵育30min。

7. PBS 冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加TSA-Fluorescein（Amplification Dilution稀释），37℃孵育10min。

8. 微波修复（去除一抗、二抗）：PBS 冲洗切片3次，每次3min，将切片浸泡于1×AR6 Buffer中，微波炉高火加热到沸腾，然后中火保持5min，再自然冷却，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（pH7.4）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。循环重复4-8步骤，直到所有一抗全部加完。

9.复染核：滴加 DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。

10. 用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。

11. 镜检拍照：将切片在PE Vectra自动化多光谱组织病理定量分析系统上进行图像采集与结果分析。

结果判读

注意事项
1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。特殊样本应用对应固定液固定；

2.组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3.切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4.烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5.蜡块及切片的保存：最好在4℃保存

6.脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化 染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7.灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。

8.暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9.封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10.抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11.背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12.在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。

                                                              送检要求