原位杂交

实验原理

以特定标记的已知序列核酸为探针，和所检测样本中核酸进行杂交，从而对目的核酸序列进行精准定位定量；

实验步骤

1.组织脱水：梯度酒精对组织进行脱水处理，75%酒精（4h）-85%酒精(2h)-90%酒精  (1.5h)-95%酒精（1h）-无水乙醇I（0.5h）-无水乙醇Ⅱ（0.5h ）；

2. 组织透明：组织块经酒精脱水后必须经过透明。透明剂（二甲苯）能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织，无水乙醇：二甲苯（1：1）（10min）-二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）

3.浸蜡：透明后的组织块依次经3缸石蜡（60℃）进行浸蜡，石蜡Ⅰ（60℃）（1h）-石蜡Ⅱ（60℃）（1h ）-石蜡Ⅲ（60℃）（1h）

以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成（机器自动程序）

4.包埋：包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。

5.切片和烤片 ：包埋好的蜡块使用徕卡病理切片机进行切片，切好的组织片放入40℃的水浴锅中进行摊片，防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃ 烤箱烤片3个小时即可。

6.切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（20min）-二甲苯Ⅱ（20min）-二甲苯Ⅲ（20min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（5min）-90%酒精（5min）-80%酒精（5min）-70%酒精（5min），然后蒸馏水浸洗5min，

DEPC水浸泡。

7.切片于修复液中煮沸10-15分钟，自然冷却。滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化5min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

8.滴加预杂交液，37°C孵育1h。

9.倾去预杂交液，滴加含探针杂交液,65℃恒温箱度杂交过夜。

10.2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗5min洗2次，0.5×SSC室温洗10min。
11.DAPI避光复染5min，清洗后用抗荧光淬灭剂封片；

12.荧光显微镜下观察。

结果判读

注意事项

1.防止RNA酶污染；
2.实验过程中不要干片；
3.修复时长可根据固定时间调整。　

                                                        送检要求