双荧光素酶实验

实验目的

荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称。双荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火荧光索酶活性的一种报告系统,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这-生物发光体系, 可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

实验原理：通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5'启动子区克隆在luciferase的上游，或把3'-UTR区克隆在luciferase的下游等，构建成报告基因(reporter gene)质粒。然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。Renilla luciferase相对更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。

实验步骤

1.取处于对数生长期，生长状态良好的细胞，接入12孔板， 37℃培养过夜；

2.按照要求对细胞进行处理；

3.细胞处理所需时间后，吸尽细胞培养液后PBS洗一遍

4.加入300ul报告基因细胞裂解液；

5.充分裂解后， 15,000rpm离心3分钟，取上清用于测定；

6.融解萤火虫荧光素酶检测试剂和Renilla 荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。Renilla 荧光素酶检测底物(100×) 置于冰浴或冰盒上备用；

7.按照每个样品需100ul 的量，取适量Renilla 荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入Renill荧光素酶检测底物(100×) 配制成Renilla 荧光素酶检测工作液；

8.取样品100 ul，加入100ul萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后测定RLU；

9.加入100 ul Renilla 荧光素酶检测工作液，混匀后测定RLU；

10.在以Renilla 荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla 荧光素酶测定得到的RLU值。

结果展示

293T细胞转染进行双荧光素酶检测：

                                                             送检要求