ELISA检测

实验方法

夹心法ELISA：

1.加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μL。待测样品加入到其他孔，每孔100μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。

2.生物素化抗体/抗原：弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体/抗原工作液100μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃孵育1小时。

3.洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。

4.HRP酶结合物：每孔加酶结合物工作液100μL，混匀，加上覆膜，37℃孵育30分钟。

5.洗涤：弃去孔内液体，洗板5次，方法同步骤3。

6.底物：每孔加底物溶液(TMB)90μL，混匀，加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

7.终止：每孔加终止液50μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.读值：立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热，设置好检测程序。

竞争法ELISA：

1.加样：将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔50 μL。待测样品加入到其他孔，每孔50 μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。立即每孔加入配好的生物素化抗体工作液50μL。混匀，给酶标板覆膜，37℃孵育45分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。

2.洗涤：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。

3.HRP酶结合物：每孔加酶结合物工作液100μL，混匀，加上覆膜，37℃孵育30分钟。

4.洗涤：弃去孔内液体，洗板5次，方法同步骤2。

5.底物：每孔加底物溶液(TMB)90μL，混匀，加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

6.终止：每孔加终止液50μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

7.读值：立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热，设置好检测程序。