番红固绿染色

实验原理

番红O是一种结合多阴离子的阳离子染料，其显示软骨组织是基于阳离子染料与多糖中阴离子基团（硫酸软骨素或硫酸角质素）结合，嗜碱性的软骨与碱性的染料番红结合呈红色。番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，间接反映了基质中蛋白多糖的含量和分布。当软骨受到损伤时，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O 淡染或不着色。嗜酸性染料的固绿与软骨下骨胶原纤维结合，不宜褪色。番红O-固绿染色的分化很关键，分化过度易导致切片不着色，分化不足易导致切片着色过深。 番红O着色与阴离子的浓度近似成正比关系，间接反映基质中蛋白多糖的含量和分布。

实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗。

2、固绿染色：切片入固绿染液5-10min，水洗去多余染液，至软骨呈无色，分化液稍浸泡，自来水稍洗。

3、番红染色：切片入番红染液15-30s，三缸无水乙醇快速脱水。

4、透明封片：干净的二甲苯透明5min，中性树胶封片。

5、显微镜镜检，图像采集分析。

结果判读

软骨呈红色或橙红色，背景绿色。

番红固绿-大鼠椎间盘-100X

注意事项

1、切片染色不好需重染时，可用自来水浸泡去除固绿颜色，用盐酸酒精浸泡去除番红颜色，将颜色全脱色后重新染即可。

2、染色时间稍有差异，会导致红色和绿色的差异较大，需注意镜下控制两种颜色的程度，自来水中能分化固绿的颜色，刚染完固绿的切片，软骨部位也会有较深的绿色着色，这时需要在自来水中分化至软骨部分绿色变浅或变成无色。但同时也要注意成骨部分的绿色颜色变化，若成骨部分颜色在分化时过浅，则需要重染固绿，再用自来水分化直到软骨部分绿色较浅或无色，成骨部分绿色较深。

3、番红O使用多次后会产生沉淀且不易着色，需及时更换染液。

4、番红O染色后，不宜在浓度低乙醇脱水，否则易褪色。也不宜染色过长，否则易导致背景的深红色不易分化掉。

                                                              送检要求